Alteraciones de la expresión genética en la sangre periférica después de una conmoción cerebral relacionada con el deporte en una cohorte prospectiva de atletas universitarios: un estudio del consorcio de evaluación, investigación y educación de conmociones cerebrales (CARE)

Resumen

Fondo

Los enfoques de base molecular para comprender la fisiopatología de la conmoción cerebral proporcionan información biológica compleja que puede hacer avanzar la investigación de la conmoción cerebral e identificar posibles biomarcadores de lesión para diagnóstico y/o pronóstico.

Objetivo

El objetivo de este estudio fue identificar cambios en la expresión genética en la sangre periférica que se inician después de una conmoción cerebral y son relevantes para la respuesta y recuperación de la conmoción cerebral.

Métodos

Analizamos transcriptomas de sangre total en una gran cohorte de atletas universitarios de control y con conmoción cerebral que participaban en el estudio multicéntrico prospectivo del Consorcio de Evaluación, Investigación y Educación de Conmociones Cerebrales (CARE). Se recolectaron muestras de sangre de atletas universitarios en la pretemporada (línea de base), dentro de las 6 horas posteriores a la lesión por conmoción cerebral y en cuatro puntos de tiempo prescritos adicionales que abarcan desde 24 horas hasta 6 meses después de la lesión. La secuenciación de ARN se realizó en muestras de 230 atletas con conmoción cerebral, 130 atletas de control de contacto y 102 atletas de control sin contacto. La expresión genética diferencial y el análisis de deconvolución se realizaron en cada momento en relación con el valor inicial.

Resultados

Las citoquinas y las vías de señalización de la respuesta inmune se activaron inmediatamente después de la conmoción cerebral, pero en momentos posteriores estas vías parecieron estar suprimidas en relación con el grupo de control de contacto. También encontramos que la proporción de neutrófilos aumentó y las células asesinas naturales disminuyeron en la sangre después de una conmoción cerebral.

Conclusiones

Las firmas del transcriptoma en la sangre reflejan la fisiopatología conocida de la conmoción cerebral y pueden ser útiles para definir la respuesta biológica inmediata y el tiempo de recuperación. Además, las vías de respuesta inmune identificadas y los cambios en las proporciones de los tipos de células inmunes después de una conmoción cerebral pueden informar estrategias de tratamiento futuras.

1 Introducción

La conmoción cerebral es un tipo de lesión cerebral traumática leve, causada por un golpe en la cabeza o un golpe en el cuerpo, que provoca un movimiento repentino de la cabeza y el cerebro. El movimiento repentino del cerebro dentro del cráneo daña las células neurales y los vasos sanguíneos, lo que provoca una alteración de la química cerebral y una breve pérdida de la función cerebral normal.1). La evaluación de una sospecha de conmoción cerebral inmediatamente después de la lesión generalmente implica un examen clínico respaldado por una evaluación de los síntomas y una evaluación del control motor y el funcionamiento cognitivo. Los síntomas comunes incluyen náuseas, dolor de cabeza, visión borrosa o confusión, y algunas personas pueden experimentar una breve pérdida del conocimiento (1). Los síntomas atribuidos a una conmoción cerebral son más comunes dentro de los primeros 7 a 10 días después de la lesión y para la mayoría de los pacientes se resuelven al mes, aunque una minoría de pacientes puede tener síntomas que persisten durante varios meses o más.2,3,4).

La conmoción cerebral es una lesión común en muchos deportes universitarios (5). Desafortunadamente, las conmociones cerebrales no se reportan lo suficiente, no sólo porque los síntomas pueden ser sutiles o no ser evidentes inmediatamente después de la lesión, sino también porque algunos atletas quieren seguir compitiendo.6, 7). La identificación rápida de la conmoción cerebral es importante porque un retraso en el diagnóstico puede prolongar la recuperación (8). Además, los individuos que vuelven a jugar antes de estar completamente recuperados tienen un mayor riesgo de sufrir otra lesión cerebral más grave.9). Debido a los desafíos relacionados con el diagnóstico de la conmoción cerebral, se necesitan enfoques de base molecular que proporcionen información biológica compleja para avanzar en la investigación de la conmoción cerebral e identificar posibles biomarcadores de diagnóstico y/o pronóstico de la lesión, así como medidas de recuperación.

Dado que los ensayos en sangre han identificado posibles biomarcadores proteicos de lesiones por conmoción cerebral, planteamos la hipótesis de que también pueden existir biomarcadores de diagnóstico o pronóstico basados ​​en la expresión genética.10). Nuestro objetivo en este estudio es identificar cambios longitudinales en la expresión genética en sangre periférica que se inician después de la lesión y son relevantes para la respuesta y recuperación de la conmoción cerebral. Analizamos muestras del Consorcio de Evaluación, Investigación y Educación de Conmociones Cerebrales (CARE), que se formó para promover el estudio de la neurobiología de las conmociones cerebrales y las consecuencias de la exposición a impactos repetitivos en la cabeza (11). Anticipamos que las firmas de expresión genética posteriores a la lesión conducirán a procesos biológicos informativos para el pronóstico de recuperación a largo plazo.

La secuenciación de ARN (RNA-seq) es un poderoso enfoque experimental que resume el transcriptoma de las células y puede usarse para inferir la expresión de genes en una muestra de tejido o sangre. Este estudio describe los hallazgos iniciales del análisis de secuencia de ARN en personas con conmoción cerebral, que abarcan la línea de base de pretemporada y múltiples puntos temporales posteriores a la lesión. Este estudio también presenta un conjunto de datos completo que estará disponible públicamente y servirá como un recurso valioso para los investigadores que investigan las consecuencias de los impactos en la cabeza, las lesiones cerebrales traumáticas y los biomarcadores de expresión genética.

2 Métodos

2.1 Participantes del estudio y recolección de muestras

La descripción completa del estudio del CARE Consortium, junto con los criterios de conmoción cerebral y el protocolo de recuperación, se detallaron anteriormente (11). Para este estudio, el Centro de Investigación Avanzada del Consorcio CARE proporcionó muestras de sangre completa que se recolectaron de una cohorte de 552 atletas cadetes/guardias marinos de la academia del servicio militar y universitarios civiles que participaron en varios deportes universitarios entre 2015 y 2019. Las muestras se extrajeron en tubos PAXgene (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey) en seis momentos: línea de base de pretemporada (Base), al inicio de la temporada deportiva antes de la lesión; post-lesión (PostInj), tomado dentro de las 6 h posteriores a la lesión; 24-48 h (24-48 h) tomadas entre 24 y 48 h después de la lesión; asintomático (Asymp), cuando un atleta comienza la progresión de regreso al juego; 7 días después del regreso al juego sin restricciones (7PostUR); y 6 meses (6Mo) desde la fecha de la lesión (11). Los atletas se dividieron en tres grupos según el estado de la lesión: atletas lesionados (INJ), que sufrieron una conmoción cerebral; controles de contacto (CCT), atletas que participaron en deportes de contacto y fueron compañeros de equipo del participante lesionado pero que no sufrieron una conmoción cerebral; y controles sin contacto (NCC), atletas que no participaron en deportes de contacto (11). En los CCT, el lapso de tiempo para las extracciones de sangre en momentos posteriores a la Base se aproximó emparejando a un individuo con un atleta INJ en el mismo equipo. Los atletas universitarios civiles del grupo INJ fueron emparejados en una proporción de 1:1 con compañeros de equipo que no sufrieron conmociones cerebrales. Los atletas de la academia militar en el grupo INJ fueron emparejados en una proporción de 4:1 con compañeros de equipo que no sufrieron conmociones cerebrales. La inscripción de los compañeros del CCT se realizó lo más cerca posible de la fecha de la lesión. Los criterios de coincidencia para los grupos INJ y CCT se basaron en la institución, el sexo, el deporte, la puntuación de la Prueba Wechsler de Lectura para Adultos (WTAR) y, para los jugadores de fútbol, ​​la categoría de posición. Los atletas de NCC e INJ fueron emparejados por institución y sexo. Eliminamos a cualquier individuo de los grupos CCT e INJ que no tuvieran una muestra inicial. Como no se recolectaron extracciones de sangre iniciales de pretemporada para los NCC, estos individuos no fueron emparejados con ningún otro participante para comparar el período de tiempo. Durante la recolección, el tiempo entre las extracciones de sangre de NCC se aproximó con respecto a la distribución del tiempo entre las citas de seguimiento de INJ a discreción de la institución que administra al respectivo participante de NCC. Durante el análisis, la extracción de sangre inicial para cada participante del NCC se redefinió como Base. Luego, se emparejaron por separado otras extracciones de sangre para el mismo participante de NCC con la muestra Base.

2.2 Preparación de la biblioteca de secuenciación

El ARN total se extrajo de las células sanguíneas utilizando el kit PAXgene Blood RNA (Qiagen) seguido de un tratamiento con ADNasa I para eliminar el ADN genómico contaminante. Se prepararon bibliotecas de ADNc específicas de cadena de doble índice a partir de ARN total eluido utilizando el kit Kapa mRNA HyperPrep (KapaBiosystems) junto con el kit de eliminación de globina humana QIAseq FastSelect (Qiagen, Germantown, MD). Las bibliotecas se prepararon en una placa de 96 pocillos utilizando una estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek FxP. Cada placa se combinó utilizando el sistema de automatización QIAgility. Las bibliotecas agrupadas se cargaron en una celda de flujo que se secuenció con una configuración de extremos emparejados de 2 × 150 pb en un instrumento NovaSeq 6000 (Illumina, Inc., San Diego, CA).

2.3 Cuantificación de la expresión genética y análisis de expresión diferencial.

Las lecturas de secuencia de los experimentos de RNA-seq se alinearon con el genoma humano (hg38) utilizando STAR v2.5.2b. Los niveles de expresión génica se cuantificaron contando el número de fragmentos de ARN alineados con regiones exónicas de genes utilizando el programa featureCounts (12). Los datos se analizaron como puntos de tiempo individuales en comparación con el valor inicial para evitar eliminar a los participantes a los que les faltaban datos de puntos de tiempo. El análisis de expresión diferencial se realizó con edgeR utilizando modelos log-lineales generalizados binomiales negativos (GLM) y pruebas de razón de verosimilitud (13, 14). Al calcular los parámetros de distribución con la función estimaDisp, se utilizó la opción robusta para anular los valores atípicos extremos. Los genes con recuentos de lecturas muy bajos se eliminaron antes del análisis de expresión diferencial para reducir el número de pruebas estadísticas individuales realizadas y evitar valores de significación inflados. Los genes se filtraron si tenían menos de 1 recuento por millón de fragmentos mapeados (CPM) en un número mínimo de muestras en cada momento. Dada la gran cantidad de muestras en cada grupo, definimos la cantidad mínima de muestras como el 25% del grupo más pequeño en la comparación (es decir, INJ versus CCT). En cada momento, los umbrales mínimos de muestra (norte) fueron los siguientes: PostInj (48), 24-48 h (58), Asymp (61), 7PostUR (57) y 6Mo (42).

El análisis de expresión diferencial se realizó por separado en cada momento posterior a la lesión, ajustando las mediciones iniciales pareadas. Dejar \(norte\) ser el número de sujetos y \(t=0,\puntos,5\) indexar los puntos de tiempo desde el inicio hasta los 6 meses. denotamos \(E\left({Y}_{it}\right)={\mu }_{it}\)dónde \({Y}_{eso}\) es la expresión genética de la \(i\)º sujeto (\(i\) = 1,…, norte) en el momento \(t\). Evaluar la expresión diferencial entre grupos a nivel \(j\)el…

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